分子生物實驗

... 故維持原狀，經離心後成團的染色體DNA及蛋白質會沉澱於管壁上，而質體會留在上清液中，再利用phenol進一步除去殘留的蛋白質，最後以酒精將質體沉澱下來即得。

分子生物實驗   葡萄糖與乳酸分析 小量抽取質體DNA 洋菜膠電泳分析 DNA定序 連接反應 核酸限制水解作用 聚合脢鏈反應 用TENS抽取大腸桿菌plasmidDNA之快速方法 利用電衝法進行大腸桿菌之轉型 利用Ca2+進行大腸桿菌之轉型 抽取酵母菌genomicDNA之快速方法 酵母菌的轉型作用 蛋白質表現 蛋白質的純化 重組蛋白質的純化 蛋白質含量測定 Yeasttwo-hybrid 西方墨點法 病毒斑點試驗 UP 回計畫二   葡萄糖與乳酸分析 目的 分析glucose及lactate在medium中的含量，藉此分析細胞在medium中生長的情形為何。

原理 利用GlucoseandLactateCombinedEnzyme-ColorReagent和glucose及lactate反應，在經由標準曲線推算sample中的量為何，可以瞭解細胞生長的代謝狀況為何。

材料 CulturecellmediumsampleCombinedEnzyme-Color Reagent 設備 微量吸管桌上離心機分光光度計(UV-Visdetector)4℃冰箱震盪混合器HoodCO2incubator 藥品 MEMmedium(orM199medium)PBS(phosphate-buffer-saline)GlucoseandLactateCombinedEnzyme-ColorReagent 步驟 1.收集培養細胞的mediumsample2.將定量之glucose及lactate溶製成control(100mg/ml，40mg/ml)溶液3.將control溶液及sample稀釋20倍，並加入一空白的試樣作為比較4.分別加入CombinedEnzyme-ColorReagent至control溶液和sample中，反應30min5.反應時避免光照，降低實驗誤差6.反應完後以分光光度計，glucose以波長450nm，lactate以波長540nm檢測7.以control溶液做基準，並推算sample中glucose及lactate的含量 時間 約1.5hr 備註 SampleGlucose(mg/L)=sample/standard*100 Samplelactate(mg/L)=sample/control*40     小量抽取質體DNA 目的 利用藥品處理，分離並純化大腸桿菌中之質體DNA 原理 先將細胞懸浮於等張溶液中，再以含有SDS的鹼性溶液(pH12.0-12.5)處理細胞，使染色體DNA變性，在加入酸性溶液(pH5.5)中和後，變性的染色體DNA會形成團狀，而質體因為supercoil結構，故維持原狀，經離心後成團的染色體DNA及蛋白質會沉澱於管壁上，而質體會留在上清液中，再利用phenol進一步除去殘留的蛋白質，最後以酒精將質體沉澱下來即得。

材料 含有質體的大腸桿菌E.coliTOP10F' 設備 微量吸管1.5ml小離心管微量離心機振盪混合器37℃恆溫振盪培養箱乾泳槽-20℃冰櫃真空抽氣機 藥品 LB培養液含有抗生素的LB培養液phenolchloroformRNaseATE緩衝液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)SolutionI：50mMglucose，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0)，經高溫高壓滅菌後保存於4℃SolutionII：1%SDS，0.2NNaOH(現配)SolutionIII：60ml5MpH5.5KOAc，11.5mlglacialaceticacid，28.5mlH2O 步驟 1.將含有質體的大腸桿菌養在3ml含有抗生素的LB培養液中，在37℃振盪培養箱中培養過夜2.取1.5ml的菌液到微量離心管中，在室溫中以14000rpm離心1分鐘，並將上清液倒掉，留下細菌沉澱物3.加入100ml的SolutionI，並以振盪器強烈振盪，使細菌懸浮於溶液中4.加入200ml新配製的SolutionII，反覆倒轉微量離心管，使之混合均勻(不可使用振盪混合器)5.加入150ml的SolutionIII，反覆倒轉微量離心管，使之混合均勻6.以14000rpm離心10分鐘，將上清液移到新的微量離心管中7.加入等體積(400ml)1:1的phenol(pH>7.8):chloroform溶液，振盪使之混合均勻，再以14000rpm離心5分鐘，將上清液移到新的微量離心管中8.加入1ml95%的酒精，振盪混合均勻後放置於-20℃冰櫃20分鐘9.以4℃14000rpm離心15分鐘，將上清液倒掉，留下DNA沉澱物，再用真空抽氣機將管壁上的酒精抽乾10.將沉澱物溶在含有RNaseA的TE溶液中，於37℃乾泳槽中30分鐘11.將DNA保存於-20℃ 時間 約2~3小時 備註 1~2毫升的菌液約可得100ng~5mg的質體DNA(其量會依據質體在宿主細胞中的複製倍數而有所不同)   洋菜膠電泳分析 目的 以agarose膠體電泳法將DNA片段依大小予以分離 原理 DNA含有磷酸根，在中性及鹼性環境下帶負電，通電後會往正極移動。

洋菜膠體內有許多孔隙，濃度越高，孔隙越小。

在電場中，不同大小的DNA片段，在洋菜膠體的孔隙內往正極移動，DNA體積月大者，移動時所受的阻力越大，使其移動較慢；而體積較小者，則移動較快。

因此藉由agarose膠體電泳的過程可將不同大小的DNA分開 材料 質體DNA 設備 電泳槽UV-lightbox電泳照相設備 藥品 TAE緩衝液Polaroid667底片1%洋菜膠(加入0.35公克洋菜膠置盛有35毫升的1xTAE之燒杯中，加熱煮沸使洋菜膠溶解。

待溶液冷卻至空手可以容忍的溫度後稱重，減輕的重量加ddH2O補足之。

)6xLoadingDye[0.25%BromophenolBlue，0.25%XyleneCyanolFF，40%(w/v)、甘油，溶解於ddH2O中]EthidiumBromide稀釋10毫克∕毫升的濃溶液成為200毫升5微克∕毫升溶液（戴手套）已定量的DNAmarker 步驟 1.置備35毫升的1%洋菜膠，降溫後倒入膠片盤中並插入17齒(tooth/well)的塑膠片(comb)於頂端，冷卻約30分鐘凝固後方可使用2.加入2μl的6×LoadingDye至樣品，混合振盪後於室溫、6,000rpm離心10秒鐘3.將膠片盤放入核酸電泳槽中，倒入約300毫升的1×TAE以蓋過膠片表面4.用微量吸管吸取5μl的marker加入靠兩端的孔中5.吸取12μl的DNA樣品並依序加入膠片的孔中6.蓋好電泳槽，通以100伏特電力約30分鐘，注意藍色染料自〝負極〞向〝正極〞移動至離膠片底部約1.5公分處即可停止通電7.將膠片於室溫下以5ug∕mlEthidiumBromide溶液染色5分鐘8.以紫外光照射膠片觀察紅色的DNA片段分布圖，並照相存檔 時間 約1小時 備註     DNA定序 目的 得知一段DNA鹼基的順序 原理 利用核?酸的類似物(analog)，因其沒有3'-hydroxylgroup而可特定地終止DNA鍊的複製，並在類似物上標定不同的螢光，用電泳將長短不一的片段分開，利用雷色光偵測不同的螢光，即可在電腦中讀出DNA的順序 材料 TemplateDNAprimerterminatorreadyreactionmix 設備 SequencingmachinePCRmachine 藥品 Buffer(80mMTris,pH9.0、2mMMgCl2)通0.22μmfilter 步驟 1.準備templateDNA，濃度以50μg/ml左右最佳2.在0.2ml微量離心管中加入下列物品：terminatorreadyreactionmix2μltemplateDNA1μlprimer(10mM)0.5μlbuffer3μl無菌水13.5μltotal20μl3.runPCRprogram a.95℃2.5min b.95℃30sec c.50℃30sec d.60℃4min(repeatb-d25cycles) 4.純化：加入2μl3MsodiumacetatepH4.6及95%ethanol50μl->室溫放置15分鐘(若有通column則可在-20℃沈澱) ->離心14000rpm，15min ->70%ethanol200μlvortex->離心14000rpm，15min->airdry5.runsequencingmachine 時間 Sample準備半天，加上機一天 備註 有廠商在賣純化的column，可得到更好的回收   連接反應(Ligation) 目的 利用酵素連接去氧核?酸載體及插入物片段 原理 去氧核甘酸連接脢(Ligase)可以將互補的去氧核甘酸終端黏合 材料 限制酵素處理過的InsertDNA及vectorDNA 設備 微量離心機混合振盪器水浴槽 藥品 連接脢(T4DNALigase)10x連接脢緩衝液 步驟 1.由限制圖譜確認insertDNA及vectorDNA的兩端可互補2.將下列試劑加入微量離心管中insertDNA6μlvectorDNA2μlT4ligase1μl10x緩衝液1μltotal10μl3.置於16℃水浴槽中作用至隔天 時間 16~18小時 備註 1.作用完的ligation溶液可在進行大腸桿菌之轉型，以得到大量的ligastion產物2.在T4ligase酵素的使用量上，為達相同的接合效率，bluntends所需的量大於stickyends10~100倍3.在做連接反應前，vectorDNA可先用CIP（去磷酸脢）處理，可得到較正確的接合產物   核酸限制水解作用 目的 以限制酵素處理含有一段insertDNA的載體 原理 限制酵素可以在雙股DNA分子上的特定序列做切割。

各種限制酵素的主要差異除辨識的DNA序列不同外，作用時所需梨子濃度、pH值及作用濃度亦有所不同 材料 質體DNA 設備 微量離心機微量吸管混合振盪器乾浴器 藥品 限制酵素限制酵素緩衝液無菌水 步驟 1.將保存於-20℃的質體DNA取出解凍，混合振盪後於室溫、6,000rpm離心10秒鐘使溶液集中於微量離心管底部2.分裝5μl的質體核DNA至新的離心管中，並加入濃度為的1單位∕μl之核酸限制?1μl、1μl的10倍反應緩衝液(10xReactionBuffer)、和3μl的無菌水，使最後體積為10μlDNA5μl限制酵素1μl10x緩衝液1μl(為總體積的十分之一)無菌水3μl（將體積補至10μl）total10μl3.若進行雙重切割，則在5μl的樣品中加入各1μl的1單位∕μl濃度之兩種不同酵素、2μl適合兩種酵素的10×反應緩衝液DNA5μl限制酵素11μl限制酵素21μl10x緩衝液2μl(為總體積的十分之一)無菌水11μl（將體積補至20μl）total20μl4.將溶液混合振盪均勻，於室溫、6,000rpm離心10秒鐘使溶液集中於微量離心管底部後，置入乾浴器中於37 ℃作用1小時 時間 90分鐘 備註 1.作用完後的質體DNA可利用洋菜膠電泳分析來DNA片段大小2.限制酵素作用的量不可超過總體積的十分之一，否則會有star activity   聚合脢鏈反應（polymerasechainreaction,PCR） 目的 在短的時間內，將某一特定的DNA序列進行量的放大 原理 利用DNA聚合?(DNApolymerase)反覆地進行DNA的合成。

首先雙股DNA於95℃被開鏈分解成單股DNA，隨後利用引子在適當的溫度下與目標DNA結合，再於72℃下利用DNA聚合酵素將混合液中的dNTP一一連接上去，便完成了第一次的複製，如此重複N次便可得到2N個DNA的PCR產物 材料 模板DNA核酸引子對dNTP 設備 PCR機器迷你電泳槽及鑄膠器 藥品 TaqDNApolymerase10XPCRbuffer1XTAEagarose 步驟 1.取一支0.2ml薄壁PCR管，各加入下列各項：模板DNA(50ng/ml)0.5mlforward引子(10mM)0.5mlreverse引子(10mM)0.5mldNTP(2mM)5mlTaqDNApolymerase0.5ml10XPCRbuffer5mldH2O38mltotal50ml2.設定PCR反應條件 a.95℃5min b.95℃15sec c.50℃15sec d.72℃15sec(repeatb-d30cycles) e.72℃5min 3.將PCR管子置入反應器中進行反應4.取10mlPCR產物進行電泳分析 時間 約3小時 備註 1.解鏈、引子黏著及延長的時間可依據DNA長短而作調整。

2.應用：A.反轉錄聚合酵素連鎖反應(ReverseTranscription-PCR，簡稱RT-PCR)，利用RNA來製備大量的DNAB.定點突變(site-directedmutagenesis)的技術，原則上可以將已知基因上任何位置的核?酸替換、刪除或加入，對於分析基因、蛋白質之結構與功能關係非常有用   用TENS抽取大腸桿菌plasmidDNA之快速方法 目的 可在短時間內將大腸桿菌plasmidDNA抽取出來 原理 快速破壞細胞壁和細胞膜使DNA流出，然後萃取DNA 材料 大腸桿菌 設備 恆溫振盪培養箱混合振盪器微量離心管微量吸管 藥品 LB培養液TENS(10mMTris-HCl、pH7.5、1mMEDTA、0.1NNaOH、0.5％SDS)95％酒精70％酒精 步驟 1.取1ml的菌液離心，14000rpm2分鐘2.小心倒掉上清液，並預留些微上清液重新懸浮菌液3.加入300ml之TENS溶液，震盪數秒4.加入150ml之3M，NaOAc(pH=5.3)溶液，震盪數秒5.離心14000rpm2分鐘，吸取上清液至乾淨的小離心管中6.加入95％之酒精900ml，混合均勻，離心14000rpm2分鐘7.倒掉上清液，加入1ml之70﹪酒精，離心14000rpm2分鐘8.將酒精倒掉，使DNA風乾9.以20ml的無菌水溶之 時間 20分鐘。

備註 此法雖然快速但抽出來的DNA純度並不高。

  利用電衝法進行大腸桿菌之轉型 目的 將帶有目標基因的重組質體DNA轉型至大腸桿菌中，利用質體DNA會在大腸桿菌中複製的特性來獲取大量的目標基因 原理 短暫的高電壓可使大腸桿菌接受外來的DNA，藉此達到轉型的目的 材料 大腸桿菌質體DNA 設備 電衝機電衝cuvette乾浴機恆溫培養箱 藥品 SOC(0.5％yeastextract、2％tryptone、10mMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgSO4、20mMglucose)含有抗生素的LB培養液及培養基冰無菌水甘油 步驟 A.勝任細胞的準備（全程冰上操作） 1.將大腸桿菌單一菌落培養在含有抗生素的LB培養液37℃隔夜 2.取500ml的菌液於10ml含有抗生素的LB培養液，置於37℃培養至OD600=0.5~0.7 3.冰浴10~15分鐘 4.離心4500rpm，4℃5分鐘 5.迅速倒掉上清液 6.加入5ml冰無菌水 7.離心4500rpm，4℃5分鐘 8.迅速倒掉上清液 9.加入5ml冰無菌水 10.迅速倒掉上清液 11.加入lml含有10%甘油的無菌水，resuspend 12.分管，存於-80℃冰箱 B.大腸桿菌之轉型 1.取適量質體DNA與1管勝任細胞混合均勻（比例不要超過1/10，否則會降低效率） 2.進行電衝 3.迅速加入SOC1ml 4.迅速將cuvette中的菌液轉移至新的微量離心管中 5.置於37℃恆溫培養箱中震盪培養1小時 6.取適量菌液塗於含有抗生素的LB培養基上7.置於37℃恆溫培養箱中12~16小時 時間 培養時間不算，約3小時 備註 1.此法所製備之勝任細胞效率約為109colonies/ug2.勝任細胞不宜存放過久，會減低其轉型效力   利用Ca2+進行大腸桿菌之轉型 目的 將帶有目標基因的重組質體DNA轉型至大腸桿菌中，利用質體DNA會在大腸桿菌中複製的特性來獲取大量的目標基因 原理 鈣離子會使大腸桿菌細胞膜較為疏鬆，在經過短暫熱休克的處理可使大腸桿菌接受外來的DNA，藉此達到轉型的目的 材料 大腸桿菌質體DNA 設備 乾浴機恆溫培養箱 藥品 LB含有抗生素的LB培養液及培養基0.1MCaCl20.1MCaCl2+15%甘油 步驟 A.勝任細胞的準備（全程冰上操作） 1.將大腸桿菌單一菌落培養在含有抗生素的LB培養液37℃隔夜 2.取500ml的菌液於10ml含有抗生素的LB培養液，置於37℃培養至OD600=0.5~0.7 3.離心4500rpm，4℃5分鐘 4.迅速倒掉上清液 5.加入5ml0.1MCaCl2resuspend 6.離心4500rpm，4℃5分鐘 7.迅速倒掉上清液 8.加入5ml0.1MCaCl2resuspend 9.迅速倒掉上清液 10.加入lml0.1MCaCl2+15%甘油，resuspend 11.置於冰上30分鐘 12.分管，存於-80℃冰箱 B.大腸桿菌之轉型 1.取適量質體DNA與1管勝任細胞混合均勻 2.置於冰上30分鐘 3.熱休克42℃90秒 4.加入1mlLB，置於37℃recover30分鐘 5.取適量菌液塗於含有抗生素的LB培養基上 6.置於37℃恆溫培養箱中12~16小時 時間 培養時間不算，約3小時 備註 1.此法所製備之勝任細胞效率約為5×106~2×107colonies/ug2.勝任細胞不宜存放過久，會減低其轉型效力   抽取酵母菌genomicDNA之快速方法 目的 可在短時間內將酵母菌的genomicDNA抽取出來 原理 利用藥品快速破壞酵母菌細胞壁和細胞膜使DNA流出,然後萃取出genomicDNA 材料 酵母菌 設備 恆溫振盪培養箱混合振盪器微量離心機微量吸管 藥品 YPD培養液TritonX-100SDSNaClTris-Cl(pH8)Na2EDTAphenol:chloroform:isoamylalcohol(25:24:1)acid-washedglassbeads 步驟 1.將小量的酵母菌置於YPD中(最少1.5ml)，在30℃震盪培養箱中培養12-16小時2.取1.5ml培養液置入微小離心管，並藉由離心機離心最大轉速5秒鐘並收集細胞3.去除上清液，並留下一些培養液，然後充分地震盪混合4.加入0.2ml的2%TritonX-100，1%SDS，100mMNaCl，10mMTris-Cl(pH8)，1mMNa2EDTA，0.2mlphenol:chloroform:isoamylalcohol(25:24:1)，再加入0.3gacid-washedglassbeads5.震盪2分鐘，加入0.2ml的TE(pH8)6.離心5分鐘，取出水層的溶液至另一個微小離心管，並加入100%酒精,混合均勻7.離心兩分鐘，去除上清液，自然乾燥後，加入0.2mlTE溶解離心物，再加入0.3mg/mlRNaseA，置於37℃5min，加入10ml4Mammoniumacetate和1ml100%酒精,混合均勻8.離心兩分鐘，去除上清液，自然乾燥後，溶於50mlTE 時間 培養時間不算,大約30分鐘(依管數不同而有而增加) 備註 1.5ml酵母菌細胞約有2-4mg的DNA   酵母菌的轉型作用 目的 利用鹼性陰離子加上熱休克快速地處理完整的細胞，以利將質體DNA引入酵母菌中 原理 在重組DNA技術中，酵母菌（yeast）乃是一種很重要的寄主生物，可用質體DNA為媒介物引入外來DNA並表現之。

其轉型技術與大腸桿菌相似，利用鹼性陰離子加上熱休克快速地處理完整的細胞，可使酵母菌的細胞外鞘發生變化，有利於吸收質體DNA。

材料 酵母菌〈?MNN10〉質體DNA 設備 30℃培養箱離心機酒精燈接種環乾浴機 藥品 Onestepbuffer(Lithiumacetate0.2N、PEG-335048%、SSDNA50mg/100ml、DTT100mM)YPD培養液selectivemedium 步驟 1.將酵母菌劃於YPD培養基中，置於30℃之培養箱中約3-5天2.挖取一些菌洛加入100ml的Onestepbuffer以懸浮酵母菌3.加入50ng~1mg的質體DNA，混勻並熱休克45℃15分鐘4.塗於selectivemedium中，置於30℃恆溫箱中3~5天5.長出的菌落即含有質體DNA，可進一步養大量作蛋白質的表現 時間 6~8天 備註 酵母菌的轉型效率在每1mg質體DNA中，約可獲取103-104轉形細胞，但不同的因子皆會影響轉形的效率，包括質體DNA吸收能力與質體的大小、DNA的構形、寄主品系等。

  蛋白質表現 目的 以大腸桿菌在試管中表現選殖的基因，大量製造蛋白質 原理 加入IPTG刺激含有lacoperon的細菌，可以調控選殖基因的蛋白質表現 材料 含有選質基因的大腸桿菌E.coli(DE3)BL21 設備 恆溫振盪培養箱混合振盪器微量離心機微量吸管分光光度計塑膠比色管 藥品 LB培養液IPTG(100mM)適當的抗生素 步驟 1.將轉殖成功的單一大腸桿菌E.coli(DE3)BL21菌株以微量吸管尖接種到5毫升含有適當抗生素的LB培養液中，於37℃以250 rpm振盪培養12~16小時 2.將1毫升菌液轉移至10毫升的新鮮LB培養液(含適當抗生素)中，於37℃以250rpm振盪培養3~4小時，直到OD600達到1.23.收集1.5毫升細菌樣品至微量離心管中，於室溫以6000rpm離心1分鐘4.倒去培養液並將離心管倒置以使沉澱物乾燥，並保存於-20℃冰櫃5.加入0.1毫升100mMIPTG溶液至剩餘的菌液，使最終濃度成為1mM6.加入IPTG後四小時、六小時及隔夜各取一次1.5毫升菌液，並離心沉澱以收集細胞7.將所有細菌沉澱物冰凍保存於-20℃冰櫃8.將所有細胞沈澱誤打破後可於SDSPAGE上看到表現量最大的時間點，則可以此條件作蛋白質大量表現 時間 約需2天 備註 每種蛋白質表現的量會依其蛋白質特性、載體特性、宿主特性、誘導時間及IPTG濃度不同而有所差別。

  蛋白質的純化(Proteinpurification) 目的 利用金屬親和性管柱(metalaffinitycolumn)來大量純化帶有affinity tag的基因重組蛋白 原理 由於六個Histidine所組成的HisTag(metalaffinitytag)可與Ni2+ bind，所以利用基因重組技術在表現的蛋白質加上HisTag，再以金屬親和性管柱(Ni-NTA)及liquidchromatography來大量純化蛋白質。

材料 Proteinsource(E.coli打破細胞後的溶液)Ni-NTAaffinity column 設備 微量吸管高速離心機incubator震盪混合器liquidchromatographycoldroomsonicater 藥品 LBmediumPBS(phosphate-buffer-saline)IPTGantibiotic(Amp)Bindingbuffer(5mMimidazole，0.5MNaCl，20mMTris-HCl，PH=7.9)Washbuffer(60mMimidazole，0.5MNaCl，20mMTris-HCl，PH=7.9)Elutebuffer(1Mimidazole，0.5MNaCl，20mMTris-HCl，PH=7.9) 步驟 1.將induce後的菌培養至適當時間後離心打破，以PBS溶取所需之protein2.先以5X管柱體積之Bindingbuffer清洗管柱，流速為1ml/min，將管柱調整至適合binding的狀況。

3.待管柱準備好之後，注入蛋白質溶液進行binding，流速降低至0.5ml/min。

4.接著以Washbuffer將多餘的蛋白質(non-bindingprotein)清洗掉，5X管柱體積，流速為1ml/min。

5.最後以Elutebuffer(highimidazoleconc.)將Targetprotein給elute出來。

時間 約4hr 備註     重組蛋白質的純化-6His親和性層析法 目的 可利用帶有鎳離子（Ni2+）的His-bind親和力管柱純化出His-tag重組蛋白 原理 因為含有His-tag的DNA序列（於目標基因之後含有6個histidine序列），因此在所表現目標蛋白質C-端帶有His-tag，此His-tag序列可與帶二價正電的陽離子相螯和，故可利用帶有鎳離子（Ni2+）的His-bind親和力管柱純化出His-tag重組蛋白。

材料 含有選質基因的大腸桿菌 設備 層析管柱（column1’10cm，可容納5ml）分光光度計超音波震盪機 藥品 Chargebuffer：50mMNiSO4BindingBuffer：5mMimidazole、0.5MNaCl、20mMTris-HClpH7.9WashBuffer：20mMimidazole、0.5MNaCl、20mMTris-HClpH7.9EluteBuffer：20~200mMimidazole、0.5MNaCl、20mMTris-HClpH7.9StripBuffer：100mMEDTA、0.5MNaCl、20mMTris-HClpH7.9 步驟 1.利用大腸桿菌大量表現重組蛋白，以一定濃度IPTG來誘導其表現，之後在4℃以4000 rpm離心20分鐘後取得菌體，若不馬上使用則可暫時將菌體凍於-70℃保存 2.將菌體打散懸浮於20毫升的bindingbuffer，並加入20毫克的Lysozyme（1mg/ml），於冰上反應30分鐘 3.之後利用超音波震盪30秒打破細胞，然後在4℃以13000rpm離心15分鐘，取其沉澱物（inclusionbody）用含有6M尿素的binding buffer將其溶解，再進行重組蛋白質純化 4.配置Ni2＋管柱:取His-bindresinmix3毫升，可配製成1.5毫升His-bind樹脂管柱，待所含之液體（20%酒精）流至將乾，取3倍體積的滅菌水通入管柱內，接著以5倍體積的charge buffer注入，再以3倍體積不含6M尿素的bindingbuffer通過，最後以3倍體積含6M尿素的bindingbuffer平衡管柱 5.將溶解在含有6M尿素的bindingbuffer重組蛋白通入已製備好的resin，在室溫下輕輕搖晃一小時，再以含有6M尿素的binding buffer及washbuffer清洗數次後，測量流出溶液OD280的吸光值，檢視是否已將其他雜蛋白清洗乾淨，最後將resin裝回管柱 6.利用不同濃度imidazoleelutionbuffer把重組蛋白沖提出來，每1毫升收集一管，並測量OD280的吸光值，以SDS-PAGE鑑定純度 7.最後resin須以stripbuffer把最後與resin結合的蛋白及Ni2+全部沖提下來，再以滅菌水沖洗數次，最後以20%酒精沖洗保存在4℃ 時間 一天 備註     蛋白質含量測定 目的 檢測在溶液中所含水溶性蛋白質的量為何 原理 利用蛋白質染劑將待測溶液及標準溶液中的可溶性蛋白質染色，再以分光光度計量測成吸光值，藉著標準溶液所得到的標準曲線來推算待測溶液的蛋白質含量。

材料 ProteinsolutionProteinDye 設備 微量吸管桌上離心機分光光度計(UV-Visdetector)4℃冰箱震盪混合器 藥品 BSA(standardprotein)ddH2OProteindyereagent(Bio-RadProteinDyeReagent) 步驟 1.將標準蛋白分別溶於二次水中，得到標準不同濃度的蛋白質溶液，分別為1000,500,250,125,62.5,31,15μg/ml2.將待測的蛋白質溶液也稀釋成1X、10-1、10-2…3.同時間在已經準備好的Dyereagent(1/4dye+3/4ddH2O)2.5ml中加入50μl的proteinsolution4.迅速的(因為dye隨時間改變)以波長595nm之分光光度計檢測標準溶液及待測溶液5.將標準溶液做一標準曲線，再由標準曲線推算待測溶液的蛋白質含量 時間 30min 備註 吸光值0.492 Protein(μg/ml)476.371   Yeasttwo-hybrid 目的 找出與已知蛋白有交互作用的其他未知蛋白 原理 將已知蛋白（餌）前接上GAL4DNA-bindingdomain（DNA-BD），並使未知蛋白接於GAL4 activatingdomain（AD），若兩蛋白有交互作用，則AD和DNA-BD會使位於GALUAS後的報導基因表現出來，使菌可存活於具有選擇性的培養基上 材料 YeastAH109DNA-BD/baitAD/libraryspermDNA 設備 30℃恆溫培養箱水浴機震盪混合器 藥品 YPDTEbuffer(1mMTris,pH8.0,100mMEDTA)1×TE/LiAcPEG/LiAc(40%PEG,1×LiAc)SD/-Trp/-Leu培養基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-gal培養基 步驟 1.刮取AH109的菌落養於5ml的YPD中，置於30℃恆溫培養箱中震盪培養16~18小時 2.室溫離心4500rpm，5分鐘 3.倒掉上清液，加入新的YPD50ml，震盪使菌體懸浮於培養液後置於30℃震盪培養3小時，使OD600=0.5~0.6 4.室溫離心4500rpm，5分鐘 5.倒掉上清液，加入25ml的TEbuffer或滅菌水，震盪以打散沈澱物 6.室溫離心4500rpm，5分鐘 7.倒掉上清液，加入1.5ml的1×TE/LiAc打散菌體，即為酵母菌勝任細胞 8.在1.5ml的微量離心管中加入0.1μgDNA-BD/bait、0.1μgAD/library、0.1mgspermDNA，並將之混勻 9.加入0.1ml的勝任細胞，並震盪使內含物混合完全 10.再加入0.6ml的PEG/LiAc，震盪使內含物混合完全 11.置於30℃震盪培養30min 12.加入70μlDMSO，溫和地將之混勻 13.熱休克42℃、15min後，置於冰上1~2min 14.室溫離心將菌體離下，除去上清液，加入1ml的YPD，30℃recovery1小時 15.14000rpm離心，除去上清液，以1ml的TEbufferwash 16.最後菌體以30μl的TEbufferresuspend，塗於SD/-Trp/-Leu的培養基上，置於30℃恆溫培養箱3~4天17.選取SD/-Trp/-Leu培養基上的菌落塗於SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-gal培養基上，置於30℃恆溫培養箱3~4天，若有菌落長出表示兩蛋白有交互作用，若無則否 時間 不算培養時間約半天 備註     西方墨點法 目的 藉由抗體的專一性來辨認目標蛋白質 原理 蛋白質經SDS-PAGE後，膠片浸入轉印緩衝液，蛋白質可被轉印到PVDF纖維膜上，再利用抗體進行免疫染色。

材料 蛋白質樣品 設備 電泳槽混合振盪器微量離心機微量吸管電泳轉印槽 藥品 Fastgreen染劑：0.1﹪fastgreen，10﹪aceticacid，26﹪ethanolTN緩衝液：0.02MTris-HCl，0.15MNaCl，pH7.5 步驟 1.蛋白質樣品以SDS-聚丙烯胺電泳展開，並轉印到PVDF纖維膜上2.轉印後之PVDF纖維膜以fastgreen染劑染色2分鐘，再以二次水漂洗退染3.褪色後之PVDF纖維膜浸泡在含有3﹪脫脂奶粉的TN緩衝液，在室溫下輕輕搖晃1小時4.TN-milk緩衝液後以TNT緩衝液（TN緩衝液1升含有0.5毫升的Tween-20）漂洗4次，每次20秒5.PVDF纖維膜將浸泡於一次抗體溶液（含IgGorIgE抗體的血清，以3﹪TNT-milk溶液稀釋所需倍數）中，在室溫下輕輕搖晃1小時或4℃下16小時6.再以TNT緩衝液漂洗6次，每次10分鐘7.再將PVDF纖維膜浸泡於二次抗體溶液（含HRP-conjugatedgoatanti-rabbitIgGantibody以3﹪TNT-milk溶液稀釋所需倍數）中， 在室溫下輕輕搖晃1小時8.以TNT緩衝液漂洗5次，每次10分鐘，再以TN緩衝液漂洗10分鐘1次9.將PVDF纖維膜以Detectionbuffer潤淨後，浸泡在呈色液至色帶出現。

倒出呈色液，加入二次水漂洗數次以終止反應 時間 兩天 備註     病毒斑點試驗 目的 利用細胞來分析病毒的特性及數量 原理 利用病毒感染及傷害細胞的特性，將逐被稀釋的病毒液與細胞共同培養，再經由染劑將存活的細胞染色而得到病毒殺死細胞所留下的病毒斑，即可推斷病毒的數量或是感染能力為何。

材料 Mammaliancellvirus 設備 微量吸管HoodCO2incubator4℃冰箱磁石攪拌器桌上離心機 藥品 MEMmedium(10%FBS)MEMmethylcelluloseTrypsin-EDTAGlutaminePBS(phosphate-buffer-saline)Antibiotic(P/S)stainsolution(Naptholblue-black) 步驟 1.將細胞養於T-flask中，當細胞生長至近乎九成滿後以2mlPBS+1mlTrypsin-EDTA加入將細胞懸浮2.加入適量之MEMmedium混和細胞，再把細胞轉養至6-wellplate中培養overnight(37℃，5%CO2)3.將待測之病毒液連續稀釋後(1X、10-1、10-2…..)，逐次將病毒液加入各個well中，輕輕拍動plate使液體均勻分散後，在放回incubator中培養1hr4.加入MEMmethylcellulose後，再培養約3~4天(依病毒之特性而定)。

5.待時間到達後，將plate中的MEMmethylcellulose吸除，逐個加入1~1.5ml的stainsolution6.靜置約一天後，把stainsolution倒掉，以清水緩和沖洗剩餘的dye。

7.可見存活的細胞為深藍色，而病毒感染過的死細胞呈現空白，即代表病毒斑8.藉由稀釋的倍數及病毒斑的數目推算病毒的數量 時間 約5~6天 備註