蛋白质结晶| 形成晶格

有很多方法可以培育蛋白质晶体；其中最常见的是蒸汽扩散和微批量结晶法。

第一种方法有两种形式，即悬滴法和沉滴法，两者的工作原理基本相同。

在密封系统中 ... 按应用自动化化学结晶和沉淀蛋白质结晶 蛋白质结晶让复杂的大分子形成结构化、有序的晶格需要更多信息/content/hk/zh/home/applications/L1_AutoChem_Applications/L2_Crystallization/protein-crystallization.fb.1.c.11.html?abcl=2需要报价 纵览应用文档相关产品{ptabslabels/customLabel} 什么是蛋白质结晶？蛋白质结晶是将通常复杂的大分子形成结构化、有序晶格的行为和方法。

固态蛋白质通常为非晶态，容易变性，晶格中的蛋白质不容易变性，更加稳定。

蛋白质在适宜的环境下会结晶。

影响蛋白质结晶过程的各个变量存在极其复杂的相互作用，因此，蛋白质结晶既是一门科学，也是一门艺术。

形成蛋白质晶体最常见的原因是为了支持结构生物学研究，通常通过X射线衍射晶体学进行。

研究人员可以通过了解蛋白质的三维结构（例如，更好地了解酶、底物和配体如何相互作用），可视化蛋白结构中允许与其他分子相互作用的区域。

此外，结晶是产生不受其他蛋白质或外界生物物质污染的纯蛋白质的有效方法，从而为制备色谱提供另一种纯化和分离方法。

 蛋白质作为治疗药物越来越重要。

然而，生产具有必要稳定性的蛋白质带来了关键的挑战，包括产品变异、结构损失(这会降低有效性)和潜在危险副产物的形成。

蛋白质结晶用来生产纯净、稳定的固体剂型，以及与蛋白质晶体相关的一些注射和输液治疗剂。

在过去，蛋白质结晶一直是支持x射线晶体学的实验室活动，但由于以蛋白质为基础的疗法的指数增长，扩大蛋白质结晶到生产水平越来越重要，是一个备受关注的领域。

扩大蛋白质结晶规模与小分子结晶基本相似，都要求在实验室规模下优化关键过程参数（CPP），以实现商业规模的结晶药物物质的关键质量属性（CQA）。

蛋白质结晶过程开发和扩大规模的整体平台通常包括：原位颗粒体系表征光谱监测和聚合物表征通过集成式模块和传感器，优化过程和反馈控制策略蛋白质结晶为何很重要？与蛋白质结晶相关的主要制药应用有：通过结构生物学实现的药物化学、蛋白质药物开发、扩大规模、分离和纯化、配方和给药。

通过结构生物学实现的药物化学。

蛋白质结晶技术的进步和X射线晶体学的完善，使人们能够推论出成千上万的三维蛋白质结构。

通过确定这些复杂大分子的结构和观察结合位点，可以详尽了解药物与受体之间的相互作用。

这些信息有助于更好地从分子水平了解蛋白质抑制剂、变构激活剂、辅助因子，甚至酶催化位点或“活性位点”，从而生产出更好的药物，提高疗效。

通过晶体学了解蛋白质抑制剂结构重要性的一个典型的例子是，在开发艾滋病毒蛋白酶方面取得的巨大进展。

基于蛋白质的治疗药物的开发、扩大规模、分离和纯化。

除了为X射线晶体学培育单一蛋白质晶体外，制药行业还加大了蛋白质晶体治疗药物的开发力度。

这些应用的目标是开发和扩大大量纯净、稳定的蛋白质晶体规模，这些晶体具有正确的粒径和良好控制的粒径分布。

相对于制备色谱法，蛋白质结晶性价比高，有可能成为大分子分离与纯化以及手性分子分离的替代方法。

扩大蛋白质结晶规模的工具与用来放大化学反应的工具类似，需要了解CPP及其对CQA的影响。

配方和给药。

蛋白质治疗药物以溶液形式给药，可通过注射或输液进行。

由于需要给予大量蛋白质，所以输注的蛋白质溶液经过了稀释，以避免出现粘度和积聚问题。

整个治疗过程需要时间来输注，这给患者和医院带来了不便，也可能导致患者对任何形式的肠胃外给药的依从性降低。

采用晶体状蛋白质混悬液非常有用，因为这些配方很少出现粘度问题，可以较高的浓度给药。

另一个关键点是，必须仔细把控蛋白质晶体粒度，确保混悬液容易通过注射或输液针头。

还有一点也很重要，配制过程中未溶解的残余晶体不能超过临界粒度，否则可能会由于晶体在毛细血管中积聚而带来不良副作用，通常要尽量减少>15µm的明显颗粒数量。

 蛋白质结晶步骤选择适当溶剂。

常见考虑因素包括可溶解的溶质质量（溶解度）、处理溶剂的可行性（安全性），以及溶剂对肽或蛋白质稳定性和自由能态的影响。

达到过度饱和。

将溶剂或缓冲液中的可溶性肽/蛋白质药物物质加热到最大允许耐受度（通常受变性限制）。

溶液将变得过度饱和。

控制CPP，使产品结晶。

通过冷却、反溶剂添加、蒸发或反应降低溶解度。

随着溶解度降低，达到晶体成核点，然后继续生长。

虽然具有高自由能的基元可能形成替代或非晶体结构，但高纯度的产品晶体应该会生成；要防止这种情况，即使CPP是可行的，也需要仔细控制。

让系统达到平衡。

这是为了最大限度提高固体药品的产量。

过滤和干燥纯化产品。

小规模蛋白质结晶有很多方法可以培育蛋白质晶体；其中最常见的是蒸汽扩散和微批量结晶法。

第一种方法有两种形式，即悬滴法和沉滴法，两者的工作原理基本相同。

在密封系统中，含有蛋白质、缓冲液和沉淀剂的一滴溶液与含有相同溶液（但不含蛋白质）的较高溶质浓度的储液器相平衡。

含有蛋白质的液滴蒸发水份，并被吸引到储液器中浓度更高的溶液中。

随着液滴中的溶质浓度升高，蛋白质开始结晶。

在微批量结晶法中，薄薄的一层矿物油下有蛋白质和其他溶剂，矿物油可以避免水份扩散。

微批量结晶法本质上是一个小型反应器，其中含有实现结晶的所有必要成分，这些成分浓度正确、稳定。

由于找到蛋白质结晶所需的一系列正确试剂、参数和条件往往靠经验，因此要让蛋白质成功结晶，最实用的方法是采用根据以往经验得出的各种实验条件。

对此，最简单的方法是使用市面上销售的蛋白质晶体筛选试剂盒，这些试剂盒包含装在多孔板中的预装缓冲液、沉淀剂等。

有了这些试剂盒，可以采用悬滴气相扩散法培育晶体。

需要大规模筛选时，可以选用高处理量系统来实现微批量结晶法自动化，从而节省时间和避免单调乏味的工作，同时尽量减少所需的纯化蛋白质量。

对于制药或工业应用所需的大规模蛋白质结晶，从筛选实验中得到的信息为在具有原位、实时PAT特点的大规模自动化反应系统中应用奠定了基础。

 大规模蛋白质结晶为支持过程开发和制造，成功结晶蛋白质最重要的初始步骤之一是确保供应充足的高纯度、特征明确的蛋白质。

蛋白质除了要纯净（不含污染物，例如发酵基质中的杂质）外，还应该在溶液中保持均质和稳定，并具备以下条件：尽量减少聚集（图A）有正确的二级、三级和四级结构（图B）任何共轭或重组修饰（图C）此外，蛋白质结晶过程中使用的所有试剂和溶剂都不能含有污染物，因为这些污染物会给成核带来重大影响。

常见的蛋白质结晶挑战与小分子结晶类似，蛋白质通过过饱和溶液结晶。

对于形成坚固晶格的小分子，主要通过调控温度来实现过饱和；这对蛋白质也非常有用。

然而，由于蛋白质晶体通常将溶剂作为晶体结构的一部分，往往对温度很敏感，容易变性和聚集，因此可以缩小温度范围。

小分子的立体自由度明显更小，因此更容易结晶。

大分子肽内部酸性、碱性、极性、非极性相互作用和排斥力更多，会妨碍有序结晶，就更大的蛋白质而言，这一现象更为严重。

大多数相容性结晶肽还含有大量的二硫键，这对于固定结构基元至关重要。

分子内部的无序程度或可能的结构变异是决定肽或蛋白质结晶而非沉淀的一个重要属性。

即使分子具有易于结晶的属性，仍有很多影响过程的参数，这些参数影响着工艺在商业上的可行性，需要对其进行表征。

除了温度外，还有一些其他因素会通过过饱和影响/帮助蛋白质结晶，其中包括调节pH值和溶液的离子强度，添加盐和沉淀剂（如PEG）以帮助降低蛋白质溶解度、现有配体的类型等。

关键是要在不干扰蛋白质正常特性的环境中，使溶液过饱和。

这说明有一点非常重要，即找出一组变量和条件，使晶体具有正确的形态、纯度和可接受的生长速度。

7种结晶机理蛋白质结晶是通过一系列相互依存的机制进行的：成核生长结晶过程中的出油团聚破碎晶种多晶型化学这些通常不为科学家所知的机制在定义结晶过程的结果中起着主导作用。

获取结晶机理指南 蛋白质结晶技术基于蛋白质的治疗药物的开发可扩大规模需要深入了解影响结晶过程的变量和条件。

与其他结晶一样，要获得所需的晶体形态、形状、颗粒粒度和粒度分布，需要仔细把控，产品质量才能保持一致。

蛋白质晶体混悬液CQA的任何变化直接影响疗效。

由于蛋白质晶体对生长环境非常敏感，容易因温度过高、溶剂损失和其他外部压力甚至取样过程而受到破坏，因此最好原位测量CPP和产品质量，即不将晶体从其溶液环境中取出。

EasyMax和Optimax自动化化学反应器能够精确控制、调整和记录各项参数，包括温度、pH值、电导率、搅拌速率以及缓冲剂和赋形剂的剂量，这对于蛋白质结晶的成功开发和扩大规模至关重要原位分析技术工具也非常有用，这些工具有助于监测、排除故障和纠正过程偏差原位拉曼光谱法和FTIR光谱仪可以跟踪试剂浓度，监测晶体结构的生长，还可以测量过饱和溶液的浓度在结晶过程的关键环节，ParticleTrack（采用FBRM）技术可以实时监测晶体粒度和粒度分布的变化情况EasyViewer可对结晶过程进行可视化和图像分析将自动化实验室反应器与实时原位分析仪结合起来使用，可以确定过程参数对团聚、生长、结块、破碎和形状变化等结晶机理的影响。

精确控制结晶过程与连续、原位监测结晶过程相结合，可根据事实、在数据驱动下实现优化和扩大规模。

用于蛋白质结晶的过程分析技术（PAT）EasyMax自动化合成实验室反应器是用于蛋白质结晶参数优化的完整工作站，可支持开发和扩大规模设计及执行。

这套全自动系统可精确控制各项过程参数。

管理CPP，其中包括加料速率、温度、搅拌、pH值和电导率可随时与结晶原位分析方法联用，包括ReactIR（FTIR）、ReactRaman（拉曼）、ParticleTrack（FBRM）和EasyViewer（原位图像分析）iCSoftware可自动执行和控制所有实验与外围设备以及全部数据采集与记录工作ReactIR使用中红外光谱测量结晶研究中的液相。

ReactIR测量不受悬浮固体、气泡或其他颗粒物质量的影响。

原位实时跟踪各个结晶溶质。

测量溶液浓度，以支持过饱和度研究为实时决策与控制提供可行的数据分析ReactRaman采用拉曼光谱，对溶液中的颗粒进行分子分析无损、原位、实时跟踪晶体的生长、结构和形态确定参数影响并优化结晶条件和变量，以实现质量目标ParticleTrack采用聚焦光束反射测量（FBRM）技术，是一种基于探头的光学仪器，可直接插入容器内，从而实时跟踪粒度与粒数的变化情况。

ParticleTrack利用弦长分布测量获得晶体粒度分布（PSD）。

随着实验条件的变化，持续监测蛋白质晶体在结晶过程中，无需去除样品即可实时跟踪批次生长或持续生长表征影响成核、团聚、多晶型和其他系统属性的条件EasyViewer是一种基于探头的仪器，可直接插入容器内捕捉粒子系统的图像。

EasyViewer进行图像分析，并从时间分辨的过程在线图像中测量粒数、粒度分布和形态，从而不断确定粒子群的变化趋势。

随着实验条件的变化，持续监测蛋白质晶体在结晶过程中，无需去除样品即可实时跟踪批次生长或持续生长实时观察影响成核、团聚、多晶型和其他系统属性的参数专刊：弦长分布（CLD）与晶体粒度分布（CSD）的转换ParticleTrack可提供实时测量弦长分布Pandit,A.,Katkar,V.,Ranade,V.,&Bhambure,R.(2018).Real-TimeMonitoringofBiopharmaceuticalCrystallization:ChordLengthDistributiontoCrystalSizeDistributionforLysozyme,rHuInsulin,andVitaminB12.Industrial&EngineeringChemistryResearch,58(18),7607–7619.作者报告称，成功开发了一种有效的方法来实时监测生物制药结晶。

此过程采用ParticleTrack来测量一系列生物制药分子在静态和动态条件下的CLD，然后运用数学模型将CLD转换成CSD。

所研究的生物分子具有不同的晶型，这取决于结晶的实验条件。

溶菌酶可产生正方形和针状晶体，rHu胰岛素可形成菱形晶体，而B12则可以形成多面体晶体。

作者开发了各种模型来计算低纵横比正方形晶体、菱形晶体、多面体晶体和高纵横比针状晶体的CSD。

作者采用了三个不同的模型来确定晶体粒度分布：另一个研究小组开发的模型假设晶体可以用球体（等效球直径，SED）表示，对低纵横比晶体有效对于高纵横比晶体，作者在本次研究中开发了一个基于宽度的模型最后，他们开发了一个基于长度的模型，并要求指定纵横比然后，将开发用于通过FBRM测量值计算CSD的模型的结果与通过图像分析获得的CSD测量值进行比较。

监测单容器批量蛋白质结晶过程ParticleTrack可监测颗粒粒径分布尝试监测不透明的结晶浆液充满了挑战，尤其是当生产规范要求窄颗粒粒度分布（PSD）时。

对于可注射蛋白质晶体制剂，PSD可极大地影响粘度，并可作为团聚或其他可能危害制剂的降解事件的早期警报。

在一项扩大规模批量结晶研究中，采用了原位监测来表征人类生长激素（hGH）晶体的形成和生长。

实时分析发现，由于容器之间的混合差异，与通常的PSD曲线存在偏差。

随后的离线图像分析（IA）证实了这一点。

观看AnjimotoAlthea,Inc.的网上技术交流讲座 各出版物中有关蛋白质结晶的文章以下是有关蛋白质结晶的一些精选期刊文章。

Orehek,J.,Teslić,D.,&Likozar,B.(2020).ContinuousCrystallizationProcessesinPharmaceuticalManufacturing:AReview.OrganicProcessResearch&Development,25(1),16–42.https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398Unno,J.,&Hirasawa,I.(2020).ParameterEstimationoftheStochasticPrimaryNucleationKineticsbyStochasticIntegralsUsingFocused-BeamReflectanceMeasurements.Crystals,10(5),380.https://doi.org/10.3390/cryst10050380Pandit,A.,Katkar,V.,Ranade,V.,&Bhambure,R.(2018).Real-TimeMonitoringofBiopharmaceuticalCrystallization:ChordLengthDistributiontoCrystalSizeDistributionforLysozyme,rHuInsulin,andVitaminB12.Industrial&EngineeringChemistryResearch,58(18),7607–7619.https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613Wang,Z.,Liu,T.,Lu,C.,&Dang,L.(2018).Manipulatingcrystallizationinlysozymeandsupramolecularself-arrangementinsolutionusingionicliquids.CrystEngComm,20(16),2284–2291.https://doi.org/10.1039/c8ce00107cKwon,J.S.I.,Nayhouse,M.,Christofides,P.D.,&Orkoulas,G.(2014).Modelingandcontrolofcrystalshapeincontinuousproteincrystallization.ChemicalEngineeringScience,107,47–57.https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005Kwon,J.S.I.,Nayhouse,M.,Orkoulas,G.,&Christofides,P.D.(2014).EnhancingtheCrystalProductionRateandReducingPolydispersityinContinuousProteinCrystallization.Industrial&EngineeringChemistryResearch,53(40),15538–15548.https://doi.org/10.1021/ie5008163Basu,S.K.,Govardhan,C.P.,Jung,C.W.,&Margolin,A.L.(2004).Proteincrystalsforthedeliveryofbiopharmaceuticals.ExpertOpiniononBiologicalTherapy,4(3),301–317.https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301 产品及解决方案实验室称量工业电子秤和称重传感器食品零售业设备瑞宁移液器和吸头分析仪器自动化化学过程检测/在线分析在线产品检测运输和物流设备服务与支持服务提供产品登记技术支持 活动&专业知识专业文库   文献:白皮书、用户指南、样本  技术文档  在线网络研讨会  视频 现场活动  技术交流会&培训  路演&展会  实时网络研讨会     关于我们招聘信息 METTLERTOLEDO 可持续发展 业务描述 全球业务 数字化 创新和品质 集团管理委员会 投资者关系新闻中心 快速链接联系我们搜索文档查找器产品搜索器服务提供 视频   此网页未针对您的web浏览器进行优化。

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