Western-blotting | 蛋白萃取方法及注意事項

(4) 使用超聲波振盪器將細胞裂解. (5) 使用4℃離心機，以轉速12000g，離心20分鐘. (6) 收集上清液，存於-20℃或-80℃. 蛋白質裂解液配方：25 mM Tris-HCl ... 首頁 WesternBlotting Western-blotting|蛋白萃取方法及注意事項2019/11/20 Western-blotting|蛋白萃取方法及注意事項   在實驗過程中，我們常常需要藉由萃取細胞組織中的蛋白質，來觀察蛋白質表現量的變化。

樣品蛋白質萃取品質的好壞非常重要，對實驗結果影響甚大，因此以下介紹蛋白質萃取方法及注意事項：   蛋白質樣品製備原則 實驗前要先充分了解實驗目的，根據實驗、分析的蛋白質，再決定如何進行樣本前處理，找出最適合的實驗方法。

原則盡可能去除非蛋白質的物質，保留蛋白質， 保留蛋白質:維持低溫處理、添加蛋白酶抑制劑可減少蛋白質降解。

去除核酸、多糖和脂類等可能產生干擾的大分子物質。

依實驗目的選擇蛋白質裂解液   蛋白質裂解液(LysisBuffer)常見成份 蛋白質裂解液(LysisBuffer)的基本組成為:pH緩衝液(pHBuffer)、離液劑(chaotropes)、表面活性劑(sufactants/detergents)、鹽類、還原劑(reducingagent)、蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitor)以及磷酸酶抑制劑(phosphataseinhibitor)。

常見的蛋白質裂解液配方：ACEBiolabs1XRIPALysisBuffer(C1020)25mMTris-HClpH7.6,150mMNaCl,1%NP-40,1%Sodiumdeoxycholate,0.1%SDS，絕大多數細胞或動物組織樣品皆可以此配方為基底，依照實驗目的添加離液劑、介面活性劑、還原劑、蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑，或調整其濃度。

離液劑(chaotropes)：也稱為變性劑，可以破壞氫鍵等次級鍵，增加蛋白質的溶解性。

代表試劑為尿素(Urea)及硫脲(thiourea)。

常用含5～8M尿素和2mol／L硫脲的緩衝液。

  界面活性劑(sufactants/detergents)：破壞蛋白質間疏水作用，增強蛋白質在其等電點值處的溶解性。

常用的是 非離子型界面活性劑non-ionicdetergents:如:丙基磺酸鹽(CHAPS)、NP-40、Tween-20。

離子型界面活性劑如SDS，不適合在等電聚焦電泳(IEF)時使用。

  還原劑(reducingagent)：斷裂蛋白質分子間的二硫鍵，使蛋白質處於還原狀態，以利肽鏈分離。

二硫蘇糖醇(DDT)在鹼性條件下常帶有電荷，在IEF過程中可能遷移出pH梯度，使某些蛋白質的溶解度降低而聚集沉澱。

三丁基磷(TBP)是非離子型還原劑，IEF過程中不會在IPG上遷移，可大大增加蛋白質的溶解度及向第二相轉移的能力。

  蛋白酶抑制劑： 因每種蛋白酶抑制劑僅作用於一類蛋白酶，所以建議聯合使用，或使用預混型的蛋白酶抑制劑:100XProteaseInhibitorCocktail(EDTA-Free)(ACEBiolabs,A1029)。

①苯甲基磺醯氟(PMSF)，抑制絲氨酸蛋白酶和部分半胱氨酸蛋白酶。

4―(2―氨乙基，苯磺醯氟作用相似於PMSF，但溶解度更好。

②乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇雙四乙酸(EGTA)，抑制金屬蛋白酶。

③肽蛋白酶抑制劑。

如亮抑酶肽(1eupeptin)抑制絲氨酸蛋白酶和部分半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制劑A(pepstainA)抑制天冬氨酸蛋白酶。

④苯甲醯胺抑制絲氨酸蛋白酶。

  磷酸酶抑制劑： 若WB的目標蛋白為磷酸化蛋白，先確認其蛋白被磷酸化的氨基酸為絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸，挑選磷酸酶抑制劑，若未知磷酸化的氨基酸，則一般選用1mMNaF&2mMNa3VO4使用預混型的磷酸酶抑制劑:100XPhosphataseInhibitorCocktail(A+B)(ACEBiolabs,A1029)。

①氟化鈉(NaF,sodiumfluoride),為絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶抑制劑(serine/threoninephosphataseinhibitor)常用濃度為1mMNaF。

②钒酸钠(Na3VO4,Sodiumorthovanadate,),酪氨酸磷酸酶抑制劑(tyrosinephosphataseinhibitor)常用濃度為2mMNa3VO4。

③焦磷酸钠(Na2P2O4,sodiumpyrophosphate)為絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶抑制劑(serine/threoninephosphataseinhibitor)常用濃度為20mMNa2P2O4。

  如何萃取蛋白質 蛋白質樣品來源有很多種，包含細胞、動植物組織、微生物，各種樣品的對應不同的樣品處理方式，以下提供通用的萃取步驟，使用者可依照實驗需求做調整。

一、細胞蛋白萃取 (1)將細胞培養盤置於冰上，移除培養液 (2)以冰PBS清洗過一次(可以使用ACEBiolabs 10XPBS(C1015) 或是 20XPBSBuffer(C1037) 稀釋)。

(3)再加入適量的裂解液 ACEBiolabs1XRIPALysisBuffer(C1020)，均勻混合。

(6Well大約每格加100ul裂解液) (4)使用超聲波振盪器將細胞裂解 (5)使用4℃離心機，以轉速12000g，離心20分鐘 (6)收集上清液，存於-20℃或-80℃ 蛋白質裂解液配方：25mMTris-HClpH7.6,150mMNaCl,1%NP-40,1%Sodiumdeoxycholate,0.1%SDS.   二、動物組織蛋白萃取 (1)將組織加入適量的裂解液ACEBiolabs1XRIPALysisBuffer(C1020)，以乾淨剪刀將組織剪碎。

(2)使用均質機與超聲波振盪器將組織裂解 (3)使用4℃離心機，以轉速12000g，離心20分鐘 (4)收集上清液，存於-20℃或-80℃ 蛋白質裂解液配方：25mMTris-HClpH7.6,150mMNaCl,1%NP-40,1%Sodiumdeoxycholate,0.1%SDS.   三、植物組織蛋白萃取 由於植物具有堅硬的細胞壁,可以再研磨過程中加入石英砂幫助打破。

此外，許多植物有含酚化合物，在空氣中很快氧化成褐色色素，可以裂解液中加入polyvinylpyrrolidone（PVPP）。

PVPP為一種不溶於水的高分子聚合物，可透過氫鍵吸附多酚，並藉由離心去除干擾物質。

(1)將樣品及石英砂放入研缽中以液態氮研磨，研磨後加入裂解液（1g樣品約加入3.5ml裂解液）於冰上靜置3小時。

(2)使用4℃離心機，以轉速12000g，離心20分鐘 (3)收集上清液，存於-20℃或-80℃ 植物組織蛋白質裂解液配方：1MTris-HCl（PH8）45ml,Glycerol75ml,Polyvinylpolypyrrordone6g,補水至300ml   四、核質分離萃取套組 若您需要進一步分析某種蛋白質在細胞核和細胞質的含量，您可以選擇使用ACExtractNuclearandCytoplasmicProteinExtractionKit(CE1017)。

透過細胞質試劑A和B，在低滲透壓條件下，使細胞充分膨脹後破壞細胞膜，釋放出細胞質，透過離心得到細胞核沉澱。

最後透過高鹽的細胞核蛋白抽取試劑得到核蛋白。

萃取得到的蛋白質為非變性，有活性，可用於Westernblot、EMSA、footprinting、報告基因檢測以及酶活性檢測等後續操作。

  蛋白樣品製備注意事項 1.盡速處理樣品，若需置放一段時間，需存於-20℃或-80℃ 2.需了解樣品特性，找出最適合的樣本製備方法，避免蛋白質未萃取完全，造成誤差。

3.保持低溫、添加蛋白抑制劑100XProteaseInhibitorCocktail(EDTA-Free)(ACEBiolabs,A1029)及磷酸酶抑制劑100XPhosphataseInhibitorCocktail(A+B)(ACEBiolabs,A1029)，儘可能減少樣品蛋白質降解。

4.透過離心並小心取出上清液，完全去除非蛋白質物質。

5.將樣品分裝存於-20℃或-80℃，勿反覆解凍樣品。

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