3 電泳 - 莊榮輝

f. 在SDS-PAGE 系統中，若SDS 的處理條件較緩和，或樣本蛋白質較不易變性者，在電泳結果上，可能會出現原態分子量的X 四元体(160 kD)。

圖3.6 Disc-PAGE 與SDS-PAGE 的比較. 目 錄 酵素純化方法 酵素分析方法 問 題集 Home 1 蛋白質定量法 2 酵素活性測定法 3 電泳檢定法 4 分子量決定法 5, 6,7 其他工具  　 　 3.1  電泳原理   3.1.1 蛋白質的泳動率   3.1.2 電泳的種類   3.1.3 電泳設備及系統選擇3.2  聚丙烯醯胺膠体電泳   3.2.1 PAGE種類   3.2.2 PAGE膠体的組成      3.2.2.1 膠體主要成分      3.2.2.2 鑄膠反應   3.2.3  PAGE系統解剖      3.2.3.1 電泳系統的組成      3.2.3.2 電泳的焦集作用      3.2.3.3 兩種電泳系統比較3.3  其它相關技術   3.3.1 染色及乾燥   3.3.2 等電焦集法 (IEF)   3.3.3 二次元電泳   3.3.4 蛋白質轉印法　 5 蛋白質構造分析6 免疫學工具7 蛋白質科技  3  電泳檢定法︰  3.1  電泳原理： TOP ▲  3.1.1 蛋白質的泳動率 a. 泳動率 帶電分子在電場中會被電流移動，是為 泳動；其泳動的大小程度稱為 泳動率 (mobility)。

泳動率與分子上 電荷密度 成正比，而與其分子 摩擦力 成反比：                           (所外加 電壓mV)×(分子之 淨電荷密度)  泳動率  ～ ─────────────────                                       分子與介質間之 摩擦力 上述之摩擦力，決定於此分子之 大小、形狀。

分子量大者摩擦力大，泳動率小；球形分子摩擦力較小，泳動率大。

　 b. 蛋白質的帶電性 蛋白質分子上的淨電荷，取決於 環境 pH 高低；若環境 pH 高於其 pI，此蛋白質帶淨負電，反之帶淨正電；若剛好等於其 pI，淨電荷為零 (正電數目等於負電)。

同一分子在不同 pH 環境下，可能帶不同 淨電荷 (圖 3.1)。

　 圖 3.1 環境pH的影響 c. 蛋白質由負極向正極泳動 電泳系統中，電子由負極流向正極； 帶負電的分子往正極跑，帶正電的分子往負極跑，不帶電者則不易泳動。

大部分電泳系統的 pH定在8.3，在此pH下，凡是pI 小於8.3的分子均帶負電荷，可以往正極跑。

　 d. 外在條件影響泳動率的因素 促進泳動： 低膠体濃度 (孔徑大)、低濃度緩衝液、高電壓、高電流、高溫。

　 降低泳動： 上述各點的相反條件、樣本含高濃度鹽類、樣本 pH太高或太低。

TOP ▲ 　 3.1.2 電泳的種類 電泳需有一介質，作為電泳之場所 (圖 3.2)。

最早是在溶液中進行，但因溶液的擴散現象大，故改用噴濕的濾紙；但又因濾紙與分子間的吸引力大，導致摩擦力太大而發熱，故現今多改用半固態的膠体。

a. 全液相電泳 (moving-boundaryelectrophoresis) 如上述已甚少使用，但有些特殊的製備式裝置仍使用類似原理。

　 b. 帶狀電泳 (zoneelectrophoresis) 因使用固相的電泳介質，蛋白質樣本電泳後在介質上呈現帶狀 (band)，故稱之。

(1) 濾紙電泳： 濾紙吸附性大，蛋白質很容易變性失活；因此多用在小分子樣本 (如胺基酸) 或雙向胜汰電泳 (蛋白質已水解成胜汰片段)。

(2) 薄層電泳： 以化學方法修飾纖維素的醇基 (乙酸化) 成為celluloseacetate，可降低對蛋白質的吸附，也可塗佈成薄層進行電泳 (thin-layerelectrophoresis,TLE)。

(3) 膠体電泳： 組成膠体的分子長鏈間，有相當大的空間，可降低與蛋白質間的摩擦力，且可增大樣本体積，適用於巨分子電泳，如核酸及蛋白質。

澱粉膠体電泳 (starchgelelectrophoresis) 聚丙烯醯胺電泳 (polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE) 洋菜糖膠体電泳 (agarosegelelectrophoresis) 　 圖 3.2 帶狀電泳的演進 c. 其它電泳技術 以下技術大多會在其他各章節中說明 (1) 等電焦集法 (isoelectricfocusing)： 根據蛋白質的等電點不同來做分離。

(2) 胜汰圖譜 (peptidemapping)：不同的蛋白質有不同的胜汰圖譜。

(3) 蛋白質轉印 (Westernblotting)→免疫染色 (immunostainning) (4) 製備式電泳 (preparativeelectrophoresis)：可以純化高純度蛋白質。

(5) 免疫電泳 (immunoelectrophoresis)： 電泳後再以抗体與抗原反應，可產生沉澱線，也是有兩個次元。

(6) 毛細管電泳 (capilliaryelectrophoresis)：最新的電泳儀器，有點像HPLC。

(7) Pulsefieldgelelectrophoresis：可做大分子 DNA 甚或染色体之分離。

　 TOP ▲ 　 3.1.3 電泳設備及系統選擇 　 a. 電源供應器 大約 100-500V者即可適用，但等電焦集法則需數千伏特。

　 b. 電泳槽 垂直或水平、柱狀或平板、普通 (16x20) 或 迷你型 (8x10)。

◆ Bio-Rad c. 系統選擇 請見下表  ◆ Hoefer 表 3.1 各種電泳形式的選擇與用途 TOP ▲ 　  3.2  聚丙烯醯胺膠体電泳： TOP ▲  聚丙烯醯胺膠體電泳 PAGE 是最普遍的蛋白質電泳方式，以下各段分別說明 PAGE的種類、構成與電泳原理；及實驗操作可能遇到的問題與解決方法。

   3.2.1 PAGE 種類  　 a. 原態膠体電泳及活性分析 Disc-PAGE 是PAGE 系列的最基本型式，蛋白質以原態進行電泳，因此酵素活性在電泳後得以保持，可在膠片上直接做活性測定或染色；若能收集到膠体上的蛋白質，則亦可用來製備酵素。

因為樣本蛋白質保持在原態下，所帶的電荷、分子大小、分子形狀等，對其泳動率均有影響，與下述 SDS-PAGE不同。

　 b. SDS 膠体電泳及分子量測定 SDS 是界面活性劑，可使蛋白質變性，並在分子表面均勻佈上一層負電荷。

因此在SDS-PAGE系統中，樣本分子的泳動率，僅取決於其分子量，而與原來分子所帶的電荷無關，故 SDS-PAGE可用來測定變性狀態 (denatured) 蛋白質之分子量，與原態 (native) 分子量可能不一樣。

　 c. 梯度電泳系統 梯度電泳使用由稀到濃的梯度膠体，膠体中的孔徑由上到下逐漸變小，樣本中分子量越小的分子，就可跑得越下面，因此它可說是依分子量大小來分離的。

但需注意許多pI大於8.3的蛋白質，在電泳pH 條件下所帶的淨電荷為正，在膠体中根本不會往下跑。

梯度電泳也可加入 SDS，成為 梯度-SDS-PAGE，則解析度將會大大的增強，是最理想的電泳型式。

　 TOP ▲ 　 3.2.2 PAGE 膠体的組成 Reagents (Serva) 　 3.2.2.1 膠体主要成分 以下這些成份共同組成了膠体 a. 單体分子 (monomer) 丙烯醯胺 (acrylamide)，H2C=CH-CO-NH2。

◆ Acrylamide及下面的Bis都有神經毒性，要帶手套，並避免吸入塵埃。

　 b. 架橋分子 (bridge) Bis [N,N'-methylene-bis(acrylamide)] 可看作兩個丙烯醯胺單体分子連結在一起，可形成分叉點，以構成立体結構。

　 c. 游基 (freeradical) 產生者 通常使用 過硫酸銨 (ammoniumpersulfate,APS) 或者riboflavin(即 維生素B2)。

◇ 過硫酸銨 與硫酸銨 是不同的試劑 d. 催化劑 TEMED (tetramethylethylenediamine)幫助游基電子的傳遞。

　 　 　 3.2.2.2 鑄膠反應 有三種基本反應 a. 游基形成 靠上述 游基產生者 生成游基，再使單体分子成為游基型式。

■ 膠體聚合反應 b. 聚合反應 游基單体可首尾相接，以連鎖反應形成大分子的長鏈。

■ 膠體聚合成網狀構造 c. 交錯連結 若架橋分子加入聚合反應，則形成網狀三次元結構。

　 TOP ▲ 　 3.2.3 PAGE 系統解剖   3.2.3.1 電泳系統的組成 如下表所示，有幾個組成因子 表 3.2 電泳膠体系統的各組成部份 　 a. 只有3,4 兩部分是膠体；各層的緩衝液成份不盡相同，其pH 也有點差異。

注意焦集膠体 (3) 的pH較低  (pH6.9,是glycine的pI)。

這些差異會造成很重要的效果： 在樣本通過焦集膠体時，可產生 焦集作用，使原來体積很大的樣本溶液，聚集成一薄層 (disc)，可增加解析度。

　 　 b. 以直立式柱狀電泳為例，電泳膠柱如圖3.3 的組成，玻璃管內的下方為分離膠体 (4)，其上則為焦集膠体 (3)。

焦集膠体上方的空間 (2)，可供灌注樣本溶液；膠柱上下兩端，分別接兩極的緩衝液槽 (1) 及 (5)，接通電源 (注意正負方向)。

■ 古典的直立式電泳 圖 3.3 電泳膠柱組成 　 c. 除了上述的柱狀電泳外，尚有平板式電泳，可分直立式或水平式。

應用在蛋白質時，以直立平板式的聚丙烯醯胺膠体為最多； 而在核酸，則以水平平板式洋菜醣膠体較普遍。

　 　 　 3.2.3.2  電泳的焦集作用 請注意下面三種分子 (如圖3.4)，在電泳時的表現： Glycine：圖中以黑點 (當環境pH>6.9時，帶負電) 或白點 (當環境pH=6.9時，不帶電之zwitterion) 表示。

氯離子： 以斜線部分表示。

樣本分子： 以兩種大小蛋白質為例。

圖 3.4焦集膠體中的三個主角     圖 3.5 焦集膠體對蛋白質分子的焦集作用 　 a. 圖3.5A：上述組成電泳的五個部分中，只有膠体的緩衝液含氯離子；而樣本溶液中則含有 glycine，沒有氯離子。

  　 　 b. 注意 樣本溶液-焦集膠体-分離膠体 三段的 pH 是不連續性的，其 pH分別為 8.3-6.9-8.9，而 glycine 的 pI 恰為6.9。

　 　 c. 圖3.5B：電泳一開始glycine 進入焦集膠体，立刻變成不帶電的的分子(白點)，泳動率變小； 同時氯離子則很快的往正極泳動，因此在氯離子與glycine 之間有一段缺乏離子的空間，電壓變得很高。

　 　 d. 然而兩電極之間，要有負離子來帶動電流，此時只得利用蛋白質來傳導。

而焦集膠体中的孔隙較疏，於是樣本分子不論大小，在此離子缺乏空間，全部快速往正極泳動，一直碰到氯離子的尾端聚集成一薄層。

　 　 e. 圖 3.5C：Glycine 慢慢通過焦集膠体，變回負離子，離子缺乏帶瓦解；蛋白質泳動到分離膠体，開始依其分子量、電荷等因素泳動。

　 　 　 3.2.3.3 兩種電泳系統比較 圖 3.6以三個虛構的蛋白質為樣本，說明disc-PAGE及SDS-PAGE 兩種電泳性質上的異同，以及電泳結果的差別。

  　 a. 假設有三個蛋白質 X, Y,Z，原態分子量大小依次為 X >Y>Z，在一般電泳的 pH (8.3)條件下，X 及Y 的淨電荷為負 (pI<8.3)，而 Z 的淨電荷為正  (pI>8.3)。

　 表 3.3 三個假設蛋白質的性質比較 　 b. 在native-PAGE只有X,Y會往正極跑，而Z 卻往負極跑，在膠体中也就看不到Z；而X的分子量最大 (160kD)，因此跑得比Y慢。

　 　 c. 在SDS-PAGE系統中 X,Y,Z以SDS處理過，表面均勻地敷上一層 SDS負電 (有相同電荷密度)，則原先的分子電荷完全被蓋掉。

　 　 d. 在SDS膠体中進行電泳時，由於X,Y,Z 分子表面均帶負電，所以都往正極跑。

又因三者的電荷密度一樣，影響其泳動率的因素，只剩下了分子量一端；分子量小的泳動率大，分子量大的泳動率小，因此 Z跑得比Y快。

　 　 e. 分子X 的原態分子量大於Y或Z，但其分子為四元体，而在 SDS-PAGE中，此四元体會被SDS 分解成為單元体，此單元体的分子量(40kD)小於Y或Z，因此表現出最快的泳動率。

　 　 f. 在SDS-PAGE系統中，若 SDS的處理條件較緩和，或樣本蛋白質較不易變性者，在電泳結果上，可能會出現原態分子量的 X四元体 (160kD)。

　 圖 3.6 Disc-PAGE與SDS-PAGE的比較 TOP ▲ 　 3.2.4 結果不佳時  　 a. 膠体不凝結 檢查 ammoniumpersulfate,TEMED,acrylamide 等試劑品質是否良好，或是APS濃度太稀。

室溫太低亦不易凝結，要稍加高APS的濃度。

■ 結果不佳十大原因 b. 膠体凝結不良 成為半固体粘液狀時，檢查膠体溶液的 百分比對否？ 是否忘了加Bis？所用的acrylamide品質是否良好？ 　 c. 下雨 染色後有許多垂直細線 (下雨)，可能是膠片中有小氣泡，或是樣本中有不溶物質，或所用樣本溶液中的 b-mercaptoethanol 品質不佳；acrylamide 溶液變質產生固体微粒後，也可能有下雨現象。

　 d. 色帶扭曲 染出的色帶形狀扭曲 (如波浪狀)，可能是蛋白質溶解度 不好，或樣本中含太高的鹽類。

凝膠不均勻時，也會有色帶扭曲的現象，可能是APS 沒有溶解完全。

　 e. 樣本干擾物質 色帶擴散太過，有嚴重拖尾現象，或左右拉寬，可能是樣本液的 pH不對 (一般是過酸)，或者樣本中的鹽濃度太高。

　 f.  溫度不均 膠片左右兩邊泳動的速度不一時，請檢查跑得慢的那個方向，有無冷氣或風扇吹來，降低一邊膠片的溫度。

　 g. 無焦集作用 色帶太粗，似無焦集作用，檢查 焦集膠体溶液的 pH是否確實為6.9。

　 h. 樣本槽要清理 有時電泳膠片結果看起來就是不好，但找不出主因；請特別在注入樣本前，每個樣本槽內用微量針筒灌入緩衝液洗過數次 (刷牙)，因為槽內的凝膠殘留物質若沒有洗淨，可能會造成看來原因不明的缺陷。

　 TOP ▲ 　  3.3  其它相關技術： TOP ▲  3.3.1 染色及乾燥 膠片在電泳後要進行染色，才能看到樣本蛋白質所呈現的色帶。

圖3.7說明數種常用的蛋白質染色法機制 (圖中數字代表下面各項染色法)。

　 a. 一般染色法 (1) 硝酸銀 (ammoniacal silver) 染色： 以銀氨錯離子形式與蛋白質結合，銀離子再還原成金屬銀的深褐色。

其靈敏度比下述 CBR染色法高十至百倍，但步驟較繁複。

(2) CoomassieBrilliantBlueR-250(CBR) 染色： 最常用的染色法，快速而方便，靈敏度中等。

利用 CBR 上的芳香基團與蛋白質的非極性區結合，以及所帶負電與蛋白質的正電基團結合。

注意染色用的 CoomassieBlue 為 R-250，不要誤用 G-250，後者用在蛋白質定量。

■ 常用的呈色方法 (列表) b.   醣蛋白 醣蛋白 (glycoprotein) 上的相鄰醇基，可用過碘酸氧化成醛基後，再以 (3) PAS(periodicacid-Schiff's)試劑染成紅色，靈敏度比CBR 低，步驟較繁複。

這些醛基也可用硝酸銀染上色，步驟稍不同，靈敏度比 Schiff試劑高。

　 c. 紫外線照射 製備式電泳後，可以用 UV300nm照射之 (4)，蛋白質會呈現 暗紫色 色帶。

　 d. KCl 沈澱法 SDS-PAGE 中濃度較高的色帶可以用0.3MKCl在4℃下浸泡15min(5)，蛋白質會呈現白色混濁，因為 SDS遇鉀形成KDS溶解度下降之故。

　 e. 活性染色法 若酵素反應會產生有色物質，則可進行 活性染色 (6)，但多數酵素須以原態PAGE膠片進行。

可惜大部分的酵素，均無法產生有色的生成物；則或可把膠片分劃，橫切成單位小片 (disk)，再以一般的活性測定法，在試管中加入基質液，分析每一小片中所含的酵素活性。

這種固相酵素的反應，可以拉長反應時間，以提高生成物濃度，方便偵測。

　 f.  放射顯像法 (autoradiography) 可檢測樣本中的放射性物質，但要以Ｘ光片壓片顯影。

　 g. 膠片乾燥法 大部分的膠片均可利用 玻璃紙三明治法 進行乾燥，效果相當良好，詳細步驟請參閱莊榮輝博士論文 p.72-74；商品的 膠片乾燥機 (geldryer)不是必要。

乾燥好的膠片，可用掃瞄機 (scanner)掃瞄，再以記錄器畫出色帶的位置及高度，與標準品比較則可定量。

乾燥後的膠片，再經過熱膠膜護貝後可以長期保存。

　 圖 3.7 各種蛋白質膠片染色方法的原理      ■ 比較蛋白質定量法 TOP ▲ 　 3.3.2 等電焦集法 (IEF) Ampholyte 是一種混合物，含有各種連續 pI的小分子。

若在聚丙烯醯胺膠体內加入 ampholyte，通電後 ampholyte會在膠体中形成一 pH梯度；當樣本中的蛋白質泳動至相等於其 pI的 pH位置時，其淨電荷會變為零 (pH=pI)，因而焦集於該處不動。

因此 IEF是依樣本分子 pI的不同來作分離，其解析度非常好。

 ■ 色層焦集法圖解  ■ 實驗課程資訊 　 3.3.3 二次元電泳 第一次元先在垂直式柱狀膠体上做 IEF，跑完後取出膠柱，水平放到平板式 SDS-PAGE的膠片上方，再進行第二次元的電泳。

二次元電泳可分析成分複雜的樣本，如細胞內的全部蛋白質或胜汰圖譜；亦可轉印到硝化纖維紙後，再以抗体做免疫染色。

第一次元也有人用 disc-PAGE，有其分離效果，亦較方便。

　 　 ■ 二次元電泳  ■ 蛋白質體研究  ◆ 蛋白質體學課程  ◆ 蛋白質體學與單株抗體應用    3.3.4 蛋白質轉印法   　 a. 電泳後若要再對膠体上的蛋白質色帶，做進一步的檢定，則須先轉印到 硝化纖維 (nitrocellulose) 紙 (圖3.8A轉印三明治)，因膠片無法直接進行操作。

近來多以 尼龍 (nylon) 取代硝化纖維紙，質地較韌、背景呈色低。

   　 b. 轉印到硝化纖維紙上的蛋白質，可用ponceau 或amidoblack染成紅色或黑色；再以 免疫染色法 (immunostaining) 專一性地染出目標分子 (圖3.8B)。

■ 免疫呈色機制 　 c. 轉印以後的蛋白質色帶，在定位後可以切出來，直接進行胺基酸定序。

■ 實驗課程資訊 圖 3.8 電泳轉印及免疫染色流程 TOP ▲ 目 錄 酵素純化方法 酵素分析方法 問 題集 Home 1 蛋白質定量法 2 酵素活性測定法 3 電泳檢定法 4 分子量決定法 5, 6,7 其他工具  [Ana3] 本網頁最近修訂日期： 2008/06/30