1 蛋白質抽取

(1) 粗蛋白質(crude protein)︰由採樣開始→ 均質打破細胞→ 抽出全蛋白質，多 ... 內的 胞器 (organelle)，則需以溫和的方法打開細胞後，再用密度離心法分離各胞器； ... 　 　 　 酵素純化 EnzymePurification 1  蛋白質抽取 ProteinExtraction 基本：科學研究 - 酵素實驗室 - 酵素 純化：蛋白質抽取 - 層析法 -其他方法 -純化策略 分析：蛋白質定量 - 活性測定 -電泳法 -蛋白質科技 總目錄 ■ 上課網 ■ 下載區 ■ 　 　 　 參考資源 目錄 1.1  如何開始？ 5W:What, Why,Where,When,How 1.2  材料來源 材料取得 差異性大  材料貯藏  1.3  均質與抽取 打破細胞  方法 提高抽出率  緩衝液 干擾物質  膜蛋白質 1.4  鹽析及沈澱法 鹽析分劃法  有機溶劑沈澱法 其他方法  問題集  抽取蛋白質一定會用到的離心機 下載[內文 pdf] [投影片pdf] [影音檔 mp4]  Wikipedia    [Protein purification] {BCbasic} 　 　 　 　 1  蛋白質抽取 參考資源 蛋白質的純化過程，可略分為三個階段： (1) 粗蛋白質(crudeprotein)︰由採樣開始→均質打破細胞→ 抽出全蛋白質，多使用鹽析沉澱法，可去除蛋白質以外的物質，並粗略地沈澱出目標蛋白質，都是利用蛋白質的基本物理化學性質，沒有什麼高科技但極為關鍵，令人深入 体驗蛋白質的基本性質。

(2) 部分純化(partially purified)︰最主要的純化階段，大多使用各種管柱層析法，乃是蛋白質純化的當家舞台，使用工具最多樣且有趣，通常都有大幅度的純化效果。

(3) 均質蛋白 (homogeneous)︰目標蛋白質更精製純化至均質，可用製備式電泳或HPLC，通常到此階段的回收率都很低，除非有特殊需求，否則不需達到如此高純度。

每個階段使用不同純化策略，並伴隨各種分析方法去評估蛋白質的質量，以監測純化效果與回收率，最後所得到的純質蛋白質，可進行更精密的分析與應用。

全貌匯整於圖 1.1。

(每張圖表均連結有960x720清晰版本) 　   {蛋白質純化技術} 1.1  如何開始： 先考慮以下諸點：                  5W a.要純化那一個蛋白質？     What?             (全面收集好目標蛋白質的所有相關資訊) b.為何要純化此蛋白質？     Why?              (仔細想一想整個研究的預定目標與期望) c.由何種材料純化？             Where?           (要選對材料並釐清分布在細胞內的位置) d.在那一個生長期？             When?            (找錯生長期就很難取得足量目標蛋白質) e.如何純化目標蛋白質？      How?             (依據目標蛋白質的性質來設計純化流程) 　 ▲ 　　 1.2  材料來源： a.材料取得： 抽取蛋白質或酵素的材料來源，通常不外動物、植物及微生物，或用動植物的細胞或組織培養。

採樣時，應考慮在那一個生長期、那一個器官或組織中，含有最高的含量。

材料的採集影響實驗的成敗，遇到材料採集有困難，或者材料品質不穩定時，更是花費時間、精神。

一定要控制穩定的材料來源！ b. 材料的差異性很大： 植物細胞與動物細胞在構造上有許多差異，因此在材料的選擇上，應特別注意。

植物的細胞壁相當堅硬，要用相當大的力量才能打破。

其細胞內的區隔較動物細胞複雜，有很大的液泡，內藏低 pH溶液以及蛋白酶等『有害』物質。

另含有葉綠体及澱粉粒，亦是植物細胞的特徵。

不同來源的材料，各有特定的採集或抽取問題，要自行嘗試解決。

c. 材料貯藏： 材料採集後馬上進行抽取，是為上上策。

但在很多情況下，材料必須冰凍貯存一段時期後，才進行抽取，則應在採集後，儘速置於 -20℃，通常先以液態氮冰凍後貯於-70℃ 冷凍櫃。

冷凍冰箱的除霜循環，可能對細胞造成傷害，要特別小心。

解凍越快越好，但避免局部過熱。

有些蛋白質或酵素材料可乾燥起來保存，在無水狀況下，可免受蛋白酶或水分子晶体的破壞，一般可用冷凍乾燥法，或製成丙酮粉末。

▲  [Plant cell] 　　 1.3  均質及抽取： a.打破細胞： 目標蛋白質若在細胞之內，則抽取的第一步，就是先打破細胞，有難有易。

例如動物的紅血球，只要改變滲透壓即可脹破，但植物的癒創組織就很堅固，要用海砂用力研磨。

有些實驗要收集細胞內的 胞器 (organelle)，則需以溫和的方法打開細胞後，再用密度離心法分離各胞器；此步驟難度較高，要參考文獻多試幾種方法。

b.打破細胞的方法： 就一般材料而言，可能用到的方法列舉如下： (1)乾式： 不用加緩衝研磨液，直接研磨成乾粉。

      液態氮研磨：材料在液態氮中凍結，以研砵打碎材料後研磨成粉。

      磨粉機：類似果汁機，原本用在乾磨中藥藥材成為藥粉。

      球磨機(ball mill)：以小球增加碰撞及研磨面積，多用在研磨酵母菌。

 (2) 溼式：都要在低溫下研磨。

      均質器：玻璃或鐵氟龍材質，是較溫和的研磨方法。

      果汁機(Waring blender)：每打一分鐘，要間歇數分鐘降溫，重複進行數次。

      Polytron：高速電動研磨機，效率極高，目前最常用的均質器。

      研砵：磨成細粉後的材料，再加入海砂或玻璃砂助磨；傳統而實用。

      玻璃球(glass bead)︰以很細的玻璃球混在樣本中，用力振盪，可打破酵母菌。

      超音波震盪(ultrasonication)：以超音波打破細胞，多用在微生物材料。

      French press：將樣本加壓快速通過細孔，以剪力破壞細胞。

c.提高抽出率︰ 分泌性的蛋白質，多散佈在材料中，只要研磨均勻，大多可抽取得到。

但在均質前，通常都要把材料先切成碎片 (增大表面積)，才容易進行抽取。

很多情況下，要先以磨粉機或果汁機打碎，否則抽出率不會很高。

材料亦可以液態氮急速冷卻，則組織變得很脆，可以磨得很細，提高抽出率，且可防止酵素活性喪失。

注意有些材料不能研磨過度，以免細胞破得太碎。

d.抽取緩衝液︰ 均質用的緩衝液体積，通常加入樣本体積的兩倍量以上，以四或五倍為宜，但事先磨成粉末的，有時要加到十倍以上才能均勻懸濁之，當然抽出率會增加，但是伴隨著出來的各種雜質或干擾物質也倍增。

可把緩衝液分成二或三次分批抽取，以增加抽出率。

e.注意干擾物質︰ 植物材料的均質過程要特別小心，因植物細胞在打破後，會劇烈降低其pH 值。

很多植物材料有含酚化合物phenolic compounds，在空氣中很快氧化成褐色色素，因吸附性強故難以去除。

含量較少者可在緩衝液加入 b-mercaptoethanol，降低催化其生成的酵素 phenoloxidase；量多時則以PVPP(polyvinylpolypyrrolidone)吸附之 (圖1.2)。

植物本身所含的色素也很難去除，可能會干擾純化步驟。

  f.膜上蛋白質︰ 有些蛋白質附著在細胞壁或細胞膜上，不能以普通水溶性緩衝液溶出，可把材料製成丙酮粉末(acetone powder)，再加入緩衝液時，稍具水溶性的蛋白質就會溶出；但有時須在緩衝液中，加入 界面活性劑(detergent)，溶出嵌在細胞膜中的蛋白質。

常用有sodiumdeoxycholate或 Triton，因後者屬非離子性分子，較不影響酵素活性及純化，多使用之。

g.去除混濁物： 均質後經離心分開可溶與不溶部分，離心無法分開的，再用過濾法，過濾可加助濾劑，如 矽藻土(celite)。

離心後，在上清表面可能會有一層浮皮，多為脂質，可撈掉或以紗布過濾掉。

▲ [Cell disruption] [French press] [PVPP] 　 [Membrane protein] 1.4  鹽析及沈澱法： 鹽析沉澱法可分離出樣本中的蛋白質，因為蛋白質在水溶液中的 溶解度，會因為溶液中所含鹽類濃度的改變而變化，可利用來沉澱蛋白質。

其作用機制是因為蛋白質分子表面電荷的改變，或因分子表面 極性或非極性 區域與水分子間作用的結果。

1.4.1鹽析分劃法︰ 各種蛋白質沈澱方法的原理及應用，在下面各小節以圖解 (圖1.3,1.4, 1.5)說明，並以文字說明整理在本節(1.4)最後面的表1.1。

1.4.1.1鹽溶(salting-in)： a. 等電點(pI) 為蛋白質電荷性質的指標，若緩衝液的pH調至此蛋白質的pI，則蛋白質分子的淨電荷為零，分子間的排斥力下降，會凝聚成大粒子沉澱下來。

此時若增加緩衝液的離子濃度 (如加入NaCl)，則蛋白質的溶解度會漸漸上升，稱為鹽溶。

b. 可能是所加入的鹽類離子包圍了蛋白質表面，與分子上的帶電基團或極性區域作用，進而增加水合效果所造成。

c. 利用這種蛋白質在其pI 沉澱的特性，把蛋白質溶液調到特定pI，就可沈澱目標酵素(當然其他相同pI的蛋白質也會一起沈澱下來)。

需注意有些酵素在pI 沉澱後，就不容易溶解回來，因此使用緩衝液也儘量避開目標蛋白質的pI，以免溶解度變差而沈澱。

  1.4.1.2鹽析(salting-out)： a. 蛋白質分子表面上 非極性區 附近的水分子，被迫滯留在此區域附近，好像附上一層親水性薄膜，藉此把蛋白質分子溶入水中。

b. 若外加入大量離子 (如硫酸銨)，則這些滯留的水分子會被抽出，與新加入的大量離子產生水合，因而暴露出蛋白質上的非極性區，這些蛋白質分子之間，因此必須以非極性基團互相結合，聚集成較大的沉澱粒子，稱為 鹽析。

  1.4.1.3硫酸銨(ammoniumsulfate)： a. 硫酸銨是一中性鹽，對蛋白質有相當好的安定作用。

又因為其離子容積較大，吸走水分子的能力也很強，成為有效的鹽析工具。

b.硫酸銨的添加是以 百分飽和度來表示(不是濃度百分比w/v)，例如大部分蛋白質可在80% 硫酸銨飽和度下沉澱。

因為硫酸銨加入的体積很大，會改變最後的總体積，很難由濃度百分比來計算，因此使用百分飽和度(% saturation)作為沈澱蛋白質的度量。

c. 飽和度隨溫度變化稍有差異，25℃ 下的飽和濃度為4.1M，即每公升加入767克固体硫酸銨；0~100%之間各飽和度的添加量要查表，而不是以767 克直接乘以百分比(%)。

d. 各種蛋白質，因其表面的非極性區域分佈不同，可以在其特定的硫酸銨飽和濃度下沉澱，一般做為最初步的純化方法，同時也可除去其他可溶物質，如核酸、醣類等。

1.4.1.4如何使用硫酸銨： a. 硫酸銨很容易吸收空氣中的水分而結塊，因此使用前要先把硫酸銨磨碎，平鋪在烤箱內(約60℃)烘過，但小心切勿過熱。

b. 添加硫酸銨時，要在冰浴中進行，不可一次把硫酸銨全部倒入，而是以小量分多次慢慢溶入，並不時攪拌，以免造成硫酸銨局部濃度過高。

待硫酸銨全部加完後，再攪拌約 10~30min，使溶解完全平衡，然後進行離心，注意所要的目標是沉澱或上清，要弄清楚！ c. 最後所得的沉澱溶解在最少量的緩衝液中，或直接以沉澱形式保存，均相當安定。

但要小心其中所含的硫酸銨，對下一步檢定或純化是否有影響，有必要可以透析法除去之。

1.4.2有機溶劑沉澱法︰ 1.4.2.1降低水活性： 若在蛋白質水溶液中加入有機溶液，如丙酮或乙醇，因為稀釋了水濃度而降低水活性，則蛋白質上親水性區域的水合度降低，開始聚集在一起產生沉澱。

也可看作有機溶劑降低溶液的介電常數，使蛋白質的溶解度降低。

應當注意，有些細胞膜上的蛋白質，若本身含有很多疏水性區，則反而更容易溶入有機溶劑中。

1.4.2.2使用有機溶劑： 要先把有機溶劑的溫度降至零度左右，緩緩加到蛋白質溶液中，並一邊攪拌使生沉澱。

以丙酮為例，大多以20~50%(v/v) 濃度來沉澱蛋白質，注意其中的v/v乃指加入前的体積比，因丙酮與水混合後，体積會稍微縮小。

溶液中若有高濃度鹽類，則會影響沉澱行為，以 0.05~0.2M離子強度為限。

1.4.2.3沉澱收集： 此法所得到的沉澱粒子較大也較重，以重力沉降即可收得沉澱，但一般仍以離心收集，可增加回收並去除丙酮。

蛋白質沉澱可涼乾，或放到布氏漏斗中，以少量乙醚洗過吹乾製成粉末，如此所得蛋白質所含有機溶液不多，通常不影響下一步驟。

1.4.3其它處理法： 1.4.3.1Polyethyleneglycol(PEG): a. PEG是一種水溶性的高分子聚合物，分子量 4,000以上的PEG可以用來沉澱蛋白質，其作用原理類似有機溶液，但使用濃度較低。

b.較麻煩的是PEG不易由蛋白質沉澱中除去 (分子量不小且無揮發性)，幸而PEG通常不會影響下一步純化步驟。

1.4.3.2去除核酸及多醣： a. 樣本溶液中若有大量核酸，可以加 protaminesulfate與之產生沉澱，再以離心去除之。

這是利用protamine 上的正電荷，與核酸的負電結合，聚合成較大複合物而沈澱。

b. 碳水化合物較難完全分離，通常期望在蛋白質沉澱時，或往後的層析法能去除之。

核酸與多醣都可以用專一性水解酶進行酵素分解，但價錢較昂貴。

1.4.3.3特殊處理法： 有些較特別的酵素，具有相當特殊的性質，可利用來純化。

例如RNase對熱非常安定，可耐到 100℃，因此可把粗酵素液加熱煮沸，除去其它蛋白質。

對強酸、強鹼或有機溶劑的特殊安定性，亦可利用之。

使用這些嚴苛的處理方法時，要特別小心考慮環境傷害。

  (每張圖表均連結有960x720清晰版本) ▲ 　 [Protein precipitation] 　 [Salting in] {等電點} [Solvation] ▲ [鹽 析] [Ammonium sulfateprecipitation] ▲ [Miscible solvent] 　 [PEG] [Protamine] 問題集  (每個問題不一定都有標準答案，甚至會引起很大的爭議，但這就是問題集之主要目的)  1.純化某甘藷塊根中的蛋白質，由粗蛋白經純化100倍後可達到均質，活性回收率約有 50%，如何略估此蛋白質在原來的甘藷材料中，佔有多少百分比？[1]  2.若蛋白質分子表面幾乎沒有疏水性胺基酸，則它容不容易被salting-out出來？[2]  3.為何蛋白質變性後容易在水溶液中沉澱下來？[2]  4.為何硫酸銨沉澱是以百分飽和度來計量，而非以重量或体積百分比？[3]  5.Salting-out的相反程序是否為salting-in？[3]  6.蛋白質樣本溶液使用較低離子濃度的緩衝液透析，可否視為salting-in的相反程序？[3]  7.在純化過程中，經過硫酸銨分劃後，發現比活性僅增加為1.05倍，則此一純化步驟有無存在必要？請解釋為何。

[2]  8.使用有機溶劑沉澱蛋白質，比之鹽析分劃有何優缺點？[2]  9.能否用純水去溶解蛋白質？說明為何？[2] 10.用有機溶劑沉澱蛋白質時，為何要在低溫下進行？[1] 11.植物細胞比動物細胞要更難以處理，請問植物細胞是有那些特殊問題？[1] 12.植物細胞在打破之後，其抽出液很容易變成褐色，其原因何在？如何防止？[1] 13.用PEG4000可以把蛋白質沉澱下來，但接著你如何除去這些PEG？[2] 14.為何硫酸銨是一種中性鹽類，而非酸性物質？[2] 15.為何蛋白質在硫酸銨的沉澱中保存會比較穩定？[3] 16.加硫酸銨進行鹽析時，若把預定加入的硫酸銨固体一次全部倒進蛋白質溶液中，而非慢慢加入，將會發生什麼問題？[3] 17.硫酸銨分劃時，各分劃的酵素分佈通常是以其總活性來評量，而非使用比活性，請說明為何。

[4] 18.用有機溶劑沉澱蛋白質時，為何會產生熱量？[3] 19.NaCl或KCl會使蛋白質在水溶液中的溶解度上升，而硫酸銨或硫酸鈉反而會使蛋白質溶解度下降，為何兩種鹽類會造成這樣的差異？ [4] 20.通常在純化核酸時，較麻煩的干擾物質不是蛋白質，而是多醣類，很不容易完全去除之，請以化學構造的觀點說明之。

[5] 21.蛋白酶可略分成四大類，請分別說明其作用機制如何。

並請列出每一類的抑制劑。

[2] 22. 有一位研究生經常要做免疫球蛋白的簡單分離與純化，他一直在實驗桌上放了一瓶硫酸銨溶液，雖然說是水溶液，但硫酸銨固体卻因過飽合而結晶在瓶底，且結晶數量不少。

每次要做硫酸銨分劃時，只要加入與樣本同体積的這種硫酸銨溶液 (上清部份)，就可以把抗体沉澱下來。

請問他這種做法適當嗎？有何應該注意之處？[4*] 23. 其實平日的濾泡式咖啡，就是一種生化實驗的抽取過程。

先把咖啡豆用研磨機磨成細粉，磨得太粗或太細，都會影響咖啡的風味，另外要注意的條件有：(1) 熱水的溫度、(2)熱水的最適量、(3)冷泡咖啡的特點、(4)過濾的時間、(5)濾紙摺法與濾器形狀、(6)過濾時是否攪拌、(7) 過濾的方式(一次濾完或分次？)，都有其講究與所根據的生化學原理。

請以泡咖啡觀察心得，整理出在進行抽取實驗時，應該注意的事項。

[5*] [題目後面方括號內的數字代表該題的難易程度，3為中等而5最難回答，標有* 為實際問題] ▲　 > 2色層分析法 > 酵素分析 ▲ ■■■ 本網頁最近修訂日期： 2020/09/19